生物化学有关酶的论文

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正常腰椎间盘是由纤维环、髓核及软骨板构成。人体椎间盘髓核是一个高度含水的组织，水分占80%～90%；干性成分中，蛋白多糖占65%，胶原约占25%，胶原纤维无定向排列成一疏松的立体网络。纤维环中水分占60%～70%；干性成分中，蛋白多糖占20%，胶原占60%。椎间盘内主要含有Ⅰ型和Ⅱ型胶原分子，从纤维环的外层到内层，胶原构成由Ⅰ型逐渐变为Ⅱ型。Ⅰ型胶原提供纤维环的张力强度，Ⅱ型胶原提供承受压力强度。当腰椎间盘突出时，髓核中的水分含量下降，胶原含量可达60%或更高。Bromley等〔5〕用狗进行的实验认为：胶原酶注入盘内剂量达400u～500u时，有纤维环内缘的轻微溶解，超过这个剂量溶解作用将增加，但也只是纤维环内缘的溶解，注入胶原酶2w之后溶解程度不再增加。孙磊等〔6〕将胶原酶注入兔椎间盘内后观察到：胶原酶注入盘内24h，可见髓核结构破坏；1w后髓核浓缩，纤维组织增生；2w时椎间盘髓核结构界线不清；4w时椎间隙狭窄，髓核结构消失。被纤维软骨替代，但纤维环的外层胶原纤维结构无变化。Sussman(1968)〔4〕首先提出并证明胶原酶可以溶解术中切取的人体椎间盘组织，证明胶原酶能迅速地、选择性地溶解髓核和纤维环中的胶原纤维。Sussman(1975)〔7〕进行的毒性试验表明：胶原酶行盘内、静脉内、腹腔内、脊柱旁及硬膜外注射有相当大的安全范围，胶原酶对透明软骨、骨及成熟的纤维组织如前、后纵韧带作用极小，对硬脊膜、马尾神经等接触也不会造成损害，腰神经根等神经实质对胶原酶不敏感，但认为胶原酶鞘内注射可引起严重的并发症。3 胶原酶用于腰椎间盘突出症治疗中的若干问题1 胶原酶治疗机理 胶原蛋白水解酶(collagenase，简称胶原酶)，其化学本质是蛋白质，是一种有催化作用的高度特异性生物催化剂，是唯一能作用于胶原组织螺旋结构的酶，能在生理pH值及温度条件下水解天然胶原纤维。人体内源性胶原酶与胶原分子在细胞内共同合成，以酶原的方式处于潜伏状态〔8〕。当椎间盘内环境改变或受到机械作用时，椎间盘纤维细胞崩解，酶激活物进入基质激活处于酶原状态的胶原酶，使其具有生物活性，胶原纤维出现降解。降解的结果引起椎间盘本身出现自溶，使纤维环强度下降，出现裂隙或破裂，并引起相应的临床症状。当外源性胶原酶以酶原的形式大量注入病变的椎间盘，便被其中的酶激活物激活。胶原酶被激活后作用于胶原分子的全部3条α-链，距氨基酸端的3/4处，将胶原分子水解为3/4和1/4两个片段，使之溶解度增加，易解链变性被其他 蛋白酶水解〔9〕，最终降解为相关的氨基酸，被血浆中和吸收。由于椎间盘的总体积明显缩小，从而使突出物减小或消失，对神经组织的压迫得以缓解或消除，临床症状得以改善或消失。2 胶原酶治疗对象选择 对胶原酶治疗对象的选择至今仍缺乏统一认识，国内外至今尚无统一标准，如何选择病例，提高治疗效果，是有待进一步探索和研究的课题。有作者〔10〕提出对椎间盘向侧后方突出大于10mm，椎间盘突出伴钙化、伴侧隐窝狭窄等均可列为适应症。目前国内多数学者比较一致认定的是：单侧腰腿痛有明显神经根压迫症状；经系统保守治疗无效者。凡伴有过敏体质、马尾综合征、代谢性疾病、椎间盘炎或椎间盘感染、心理变态、腰椎管狭窄或脊椎滑脱、非椎间盘源性腿腰痛、孕妇及14岁以下儿童、突出物游离于腰椎管内及突出物已钙化或骨化者均不宜列为治疗选择。适应症的选择恰当与否，直接关系治疗效果，故此笔者认为对治疗对象应慎重选择，不宜过宽。3 胶原酶治疗方法 目前临床上主要有以下5种方法：(1)经皮斜刺或侧方直刺椎间盘(盘内)注射法。此法是经典注射法，适用于各种类型的椎间盘突出，尤其适用于椎间盘膨出、中央型突出或偏斜不重者。其穿刺途径安全，定位客观，精确可靠，效果确实，但操作要求准确。笔者主要采用此法，我们认为此法具有针对性强，直接溶解胶原纤维的作用。(2)经皮椎间孔硬膜外侧隐窝突出物局部(盘外)注射法。此法适于突出物偏向一侧，而且突向神经根管，临床有神经根刺激症状者。此法针对突出物，准确性要求高，术中需造影确定，效果可靠。(3)经椎板外切迹或小关节内缘行硬膜外侧隐窝穿刺法。此法系盘外注射的改进法，由宋文阁等〔11〕提出并应用于临床。此法进路骨性标志清楚，定点明确，进针角度和方向固定，可变范围小，但其应用时间较短，目前临床报道较少。(4)经皮棘突旁硬膜外注射法。它是经椎板间隙利用硬膜外套管注射法。适用于多间隙突出或老年体弱有明显骨质增生并有骨桥形成者。在操作时需在最高位间隙穿刺插管，并将硬膜外导管送到最低突出间隙，边退管边向突出区域注药。此法简单、安全，但效果不如其他方法 。(5)经皮切吸与胶原酶注射联合法。此法是先将椎间盘髓核组织吸出，使椎间盘内压力降低并有一定空隙，再注入胶原酶，使药液均匀地渗透到纤维环部，髓核及纤维环得到充分溶解。但其操作复杂，外套管针较粗，创伤相对较大。目前国外均采用盘内法注射，国内盘内、盘外均有使用。4 胶原酶临床疗效及与手术疗效对比 目前国内报道胶原酶治疗优良率在60%～84%，有效率在83%～96%。笔者治疗25例，优良率为74%，有效率为92%，基本上报道一致。经过比较，盘内法与盘外法治疗疗效并无明显差异。Weinstein(1986)〔12〕将胶原酶注射与手术组进行了详细比较，其结果为：化学溶核组治疗后近期疼痛缓解者为51%，手术组为41%；3个月后疼痛缓解者化学溶核组为75%，手术组为70%；1年后化学溶核组为86%，手术组为80%；2年以上无需其他治疗者分别为86%与88%。治疗后第一年度复发率化学溶核组12%，手术组18%；10年后化学溶核组为32%，手术组为39%，需再次手术。治疗后短期感觉良好，恢复工作者化学溶核组为90%，手术组87%。根据比较，化学溶核组的有效率高于手术组，而复发率却低于手术组。化学溶核术显得更为优越。5 胶原酶治疗的副反应与并发症1 副反应 ①疼痛反应。一般在治疗后3～10天疼痛可比治疗前加重，但笔者体会往往多在注药后1～2h后即开始出现疼痛加重。其原因是胶原酶的注入增加了盘内容积，同时胶原纤维在胶原酶作用下出现降解。导致椎间盘内容物增加，使盘内压升高及降解过程中的化学刺激反应，窦椎神经受到激惹后出现的〔13〕。 ②尿潴留和肠麻痹。是由于盘内压力增高后窦椎神经受到激惹引起植物神经功能紊乱所致〔13〕。 ③脊柱失稳性腰背痛。椎间盘溶解后椎间隙变窄，小关节将出现重叠，对窦返神经的刺激，出现反射性腰背部不适和疼痛。2 并发症 ①过敏反应。胶原酶作为一种生物制剂，存在过敏反应的可能。杨述华等〔14〕报道1例二次注射发生过敏反应；谢国华等〔15〕报道1例于注射后8h出现过敏性休克。 ②椎间隙感染。主要表现为腰肌痉挛，腰痛加剧，有深压痛，白细胞计数和分类可正常或升高，血沉增快。高翔等〔16〕报道1例椎间隙感染。 ③神经损伤。多为穿刺针刺伤脊神经根或穿刺过程中误伤脊膜或神经外膜，高浓度胶原酶使神经根发生脱水、变性，一旦误入蛛网膜下腔，轻者出现化学性脑膜炎，重者可发生截瘫。高翔等〔16〕报道2例神经损伤致腓骨长、短肌瘫疾，经治疗后一个月恢复。汤华丰等〔17〕报道全麻下2例产生腰神经根症状，半年后随访尚未完全恢复。鞠作金等〔18〕报道1例出现化学性脑膜炎及严重的神经根损伤，术后1年随访肌力仍未完全恢复。 ④继发性腰椎管狭窄。6 尚未解决的问题1 胶原酶用量问题 目前报道盘外注射胶原酶用量基本一致，都为1200u；但盘内注射用量尚未完全统一，各家报道有400u、600u、1200u三种规格。另外，椎间盘病变程度与所用胶原酶剂量问题尚未达成统一标准。2 有关造影剂使用问题 目前盘外注射一致使用造影剂进行定位，而盘内注射定位时是否非要使用造影剂问题并未达成一致，各家观点不一。临床上有单纯靠腰椎正、侧位定位的，也有在此基础上注射造影剂行椎间盘造影定位。另外，造影剂是否对胶原酶的溶解作用产生影响这一问题仍未见有系统研究报道。3 副作用和并发症问题 如何有效地预防和治疗胶原酶注射产生的副反应及并发症，目前尚未达成一致的方案。另外，对所有治疗的病例进行系统、完整的CT及X线复查结果方面，仍未见有完整、准确的临床报道。 综上所述，只要严格掌握适应症以及正确熟练的操作方法，胶原酶注射溶解术不失为一种有效的治疗方法。且疗效与手术治疗无明显差异。它住院时间短、操作较简单、并发症少、痛苦小、病人负担较轻且安全有效，即使失败也不影响再次手术，为腰椎间盘突出症增加了一种可供选择的治疗方法。相信随着胶原酶基础研究的不断深入及临床应用的进一步开展，胶原酶注射法必将成为继传统保守治疗之后首选的治疗方法，值得临床推广应用。参考文献1 Mixter WJ,Barr JSRupture of the intervertebral disc with involvement of the spinal New Eng J Med,1934,211:2102 Hirsh CStudies on the pathology of low back J Bone Joint Surg,1959,41B:2373 Smith LEnzyme dissolution of the nucleus pulposus in JAMA,1964,187(2):1374 Sussman BJIntervertebral clisolysis with J Natal Med Assoc 60(may),1968:1845 Bromely JW,Varma AOSantoro AJ,et Double-blind evaluation of collagenase injection for herniated lumbar Spine,1984,22:1326 孙 磊，宁志杰，王培杰，等胶原酶椎间盘内注射后的形态观察中国矫形外科杂志，1997，4(5)：3947 Sussman BJJ NeuroSurg,1975,42:389～3958 张昌疑主编生物化学第2版人民卫生出版社，1984：85～1169 Smith ELConnectiro In:Principles of New York:Mc Graw-Hill,1983:22310 王执民，王义清，吴智群，等注射胶原酶治疗腰椎间盘突出症的临床应用研究实用放射学杂志，1997，13(8)：458～46011 宋文阁，傅志俭，马 玲，等硬膜外腔侧隐窝穿刺的研究中华麻科学杂志，1998，18(4)：25012 Weinstein JN,Lehman TR,Hejna 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从1981年至今已公开发表论文50余篇，其中用英文发表在国外杂志上的论文10余篇。英文专著（合著）二部。发表主要相关论文（中文）：1) 胡军 (1983): 微生物利用半纤维素《应用微生物》13(3)14-172) 胡军 (1984): 生物工程学与发酵技术 《无锡轻工业学院学报》8(3)76-3) 胡军 (1984): 环氧聚胺-一种细胞固定化的新型交联剂《生物化学与生物物理进展》11(3)77-784) 胡军 (1988)：葡萄糖氧化酶电极的研究《工业微生物》18 (2) 4-5) 胡军（1989）：积极发展新型生物传感器 《解放日报》106) 胡军和Robert Foster（1989）：用橘红诺卡氏菌发酵生产胆固醇氧化酶《微生物学通报》16（6）337-3407) 胡军 (1990)：媒体酶电极《生物化学与生物物理进展》17 (3)198-2018) 胡军和MHendry (1990)：二茂铁改良葡萄糖氧化酶电极《生物化学与生物物理进展》17 (3) 235-2369) 胡军和Anthony Turner (1990)：苯醌修饰葡萄糖氧化酶电极《生物工程学报》6 (4)328-33110) 胡军 (1990)：氧化还原酶活中心和有机金属之间的电子交换《工业微生物》20（2）13-1711) 胡军 (1991)：TCNQ-一种用于酶电极研究的新型导电介体《微生物通报》19 (1) 38-4012) 胡军 (1991)：新型生物传感器的研究和应用《工业微生物》13) 胡军（1992）：TTF改良葡萄糖氧化酶电极用于发酵葡萄糖测试《工业微生物》18 (2)13-1514) 胡军 (1992)：生物传感器 <文汇报> 15) 胡军 (1995)： 快速血糖测试仪为家庭测血糖提供方便 <北京日报> 1416) 胡军 (1995)：快速血糖测试仪使用问答 <北京日报> 2117) 胡军 (1996)：丝网印刷电极的研究与应用 《化学传感器》5 (1)18-2018) 胡军 (1996)：临床诊断与生物传感器《传感器世界》2 (4)22-2319) 胡军（1998）：酶蛋白结构稳定性对商品酶电极影响的研究《工业微生物》28 (4)1-320) 胡军 (1999): 酶技术发展和酶定向进化《工业微生物》29 (4)37-4221) 陈滋青,胡军和Axel Warsinke (2000) 双酶电极法测定L-苯丙氨酸的研究《工业微生物》30(1)5-8

生化酶类项目室内及室间质控评价与分析目前，随着《医疗事故处理条例》举证颠倒的需要，医学检验质量控制工作显得尤其重要，检验质量的科学治理受到广泛重视。我科在做好室内质控的同时，参加了历年来生化室间质控活动。本文主要对我科生化酶类项目室内、室间质控结果进行了评价和分析。1 材料、方法及项目1．1 质控血清 室内进口液体质控血清BackmanLevel 1(L1)和Level 3(L3)两个浓度水平，由金坛试剂站提供。室间质控血清由省临检中心提供。1．2 试剂、仪器及方法学分类 使用上海复旦张江公司的酶类生化试剂，并在岛津CL-7200全自动生化分析仪上按使用说明优化编程测定。1．3 测定时间、方式 2个批号的室内质控血清天天上午随机顺序上机丈量，天天丈量一次。室间质控血清按临床中心要求进行。酶类项目反应温度是37℃ ，每月均对结果进行统计处理，并在每季度28日前寄回省临床中心。我室对22项进行了测定评价，其中酶类项目7项，分别是ALT、AST、ALP、GGT 、CK 、LDH—L、AM Y。1．4 评价方式 靶值；标准差(S)；变异系数(CV)；均匀误差；组内室间质评靶值，标准差，变异系数。2 结果7种酶类项Et室内质控评价结果见表1，室间质控评价见表2，均匀误差见表3。室内质评7种酶类项目S、RCV均小于组内相同条件实验室均匀水平，室间质评按PT评价方案均符合，各项得分均为100分。3 讨论近年来，随着省临检中心同一订购室内质控品，我科完善了室内质量控制制度，并对工作职员进行了质控专题培训，为进步生化检验质量建立了良好的基础。采用了室内质控CV和室间质控cV同步评价方式，及时了解和把握了我科结果正确与否以及在全省质量控制活动中出现的题目，查找和分析结果出现误差的原因，寻求解决的方法，进步了我科生化质量治理水平。室内质控两个批号血清的均匀值，从表3统计来看，我室ALT、AST、ALP、CK、AMY 质控血清L1均匀误差为25，GGT均匀误差为50，室间质控各项结果在02-- 09之间。分析原因可能由于仪器试剂冷躲室故障使试剂质量受到影响，同时省中心质控尚有特殊对待可能。通过使用“同一”浓度质控物做室内质控，使得各参评单位有了一个相对恒定的“标准”，可利用“中心”的反馈信息，经常性校对本实验室的测定结果，以求得与其他实验室结果的一致。可见使用全省相同浓度的质控血清且认真测定，按时回报室内质控结果，对进步室间质评成绩的意义很大。