基因编辑的分类

什么是基因编辑？

《重新设计生命》（[英]约翰·帕林顿）电子书网盘下载免费在线阅读资源链接：链接： 提取码：sssk    书名：重新设计生命作者：[英]约翰·帕林顿译者：李雪莹豆瓣评分：8出版社：中信出版集团股份有限公司出版年份：2018-5-1页数：354内容简介：这本书是基因组编辑技术的科普类书籍。近年来在国际上，基因组编辑技术开始用于白血病、艾滋等疑难杂症的治疗上。我国“十三五”发展计划将重点发展基因组编辑技术，了解这一技术对于大众来说是必不可少的，因此本书具有广阔的市场空间。作者是牛津大学细胞分子研究的专家，对基因组编辑技术有着领先地认识。这本书是一部全面介绍基因组编辑技术的科普著作。作者从人类最初的基因工程研究开始，全面讲述了基因工程的发展，基因组编辑技术在生物育种、临床治疗、农业、科研领域的运用以及未来的发展。在基因组编辑的过程中，找到一把自带“导航系统”的“基因剪刀”至关重要。CRISPR/CAS9就是近年来出现的“基因剪刀”，因其构成简单、编辑效率高且容易操作，成为基因组编辑炙手可热的工具。它可以为我们提供治愈HIV，遗传疾病甚至癌症的方法，有助于解决世界饥饿危机、建立疾病研究模型甚至改造人类基因。然而，如果我们真的要把基因组编辑的巨大潜力用于人类，那么全面了解这项技术的影响和作用是至关重要的。只有这样，我们才可以决定基因组编辑技术是否真的应该开启人类设计生命的新纪元。作者简介：约翰·帕林顿，牛津大学细胞分子学教授、分子药理学家、牛津大学伍斯特学院院士，著名的媒体科普类专栏作家，著有《更深的基因组：为什么人类基因组比眼睛更多》。他曾在国际著名科学杂志，如《自然》《细胞生物学杂志》，发表80余篇专业文章。约翰·帕林顿主要研究生殖和早期胚胎发生的分子机制，以及理解细胞信号传导的基因组和蛋白质组学方法。

排放冷却是对流冷却的另一种。与再生冷却不同，用于排放冷却的冷却剂对推力室冷却吸热后不进入燃烧室参与燃烧，而是排放出去。直接排放冷却剂会降低推力室比冲，因此需要尽可能减少用于排放冷却的冷却剂流量，同时只在受热相对不严重的喷管出口段采用排放冷却。还有一种是辐射冷却，其热流由燃烧产物传给推力室，再由推力室室壁想周围空间辐射散热。辐射冷却的特点是简单、结构质量小。主要应用于大喷管的延伸段和采用耐高温材料的小推力发动机推力室。在组织推力室内冷却时，是通过在推力室内壁表面建立温度相对较低的液体或气体保护层，以减少传给推力室室壁的热流，降低壁面温度，实现冷却。内冷却主要分为头部组织的内冷却（屏蔽冷却）、膜冷却和发汗冷却三种方法。推力室采用内冷却措施后，由于需要降低保护层的温度，所以燃烧室壁面附近的混合比不同于中心区域的最佳混合比（多数情况下采用富燃料的近壁层），造成混合比沿燃烧室横截面分布不均匀，使燃烧效率有一定程度的降低。膜冷却与屏蔽冷却类似，是通过在内壁面附近建立均匀、稳定的冷却液膜或气膜保护层，对推力室内壁进行冷却，只是用于建立保护层的冷却剂不是喷注器喷入的，而是通过专门的冷却带供入。冷却带一般布置在燃烧室或喷管收敛段的一个横截面上。沿燃烧室长度方向上可以有若干条冷却带。为提高膜的稳定性，冷却剂常常经各冷却带上的缝隙或小孔流入采用发汗冷却时，推力室内壁或部分内壁由多孔材料制成，其孔径为数十微米。多孔材料通常用金属粉末烧结而成，或用金属网压制而成。此情况下，尽可能使材料中的微孔分布均匀，是单位面积上的孔数增多。液体冷却剂渗入内壁，建立起保护膜，使传给壁的热流密度下降。当用于发汗冷却的液体冷却剂流量高于某一临界值，在推力室内壁附近形成的是液膜。当冷却剂流量低于临界值流量时，内壁温度会高于当前压力下的冷却剂沸点，部分或全部冷却剂蒸发，形成气膜。除了以上热防护外，还有其他热防护方法如：烧蚀冷却、隔热冷却、热熔式冷却以及室壁的复合防护等。3 高焓气体发生器热防护方案综合上述方法结合实际情况，便得到高焓气体发生器的热防护方法。高焓气体发生器的燃烧室与液体火箭发动机的不同，省去前面的推力室部分，使得其结构更简单而有效。那么，所涉及到的热防护即为对燃烧室室壁的热防护部分。由于燃料进入燃烧室内迅速分解并放出大量

ZFNZFN，即锌指核糖核酸酶，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et , 1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et , 1994)，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。TALENTALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。CRISPRCRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。但最近研究发现，虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。三种系统的比较那么，可能会有人疑问了，既然如此，这三种系统的区别和联系又是什么呢？小编特意从有效性，特异性，载体性及其它四个方面，进行了一个小小的总结。有效性在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的，并且这也依赖于每种细胞的转染的效率。因此，只能点对点的比较靶向位点，细胞系和转染方法，这样的比较才有意义。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验，我们在细胞系水平上进行了比较，虽然他们可能与不同的突变特征有关。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析，发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况，观察到，通过用CRISPR更换掉TALENs，在其他方面条件相同的情况下，通过产生更多的基因突变的克隆，本质上提高了效率。最近，功能上重新编码的TALENs（reTALENs）已经得到了发展，并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高。但是这个研究发现，CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率，并且其一定程度的比HE更有效率，挡雨ODN捐赠者进行比较。特异性ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的，其特异性是由DNA绑定的区域决定的，这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp。然而，在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸，它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的。这表明，3’12个碱基的“种子序列”是最关键的，而剩下的8个碱基（非种子序列）甚至PAM序列都是可以错配的。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行，并且发现存在频率低，但是可以检测到的脱靶事件的发生，其可以定义为一个高度有限的一部分。已经有研究表明，TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。基于这个研究，TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%，而在高度同源的CCR2位点上只有1%。相反，CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的，CCR5位点的突变频率是14%，而CCR2的是12%。几个研究也报告了，CRISPR/Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测（即，H2AX免疫染色）中都没有明显的脱靶现象。然而，最近的研究发现，CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象。例如，靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%，这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性，其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配，从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入（插入缺失）。此外，靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标，而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的。已经有报告说，脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服。此外，在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性。病毒为基础的传递ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递。当前，ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体，每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体。相反，腺病毒，但不是基于HIV的慢病毒，载体使用与TALEN的基因的传递，因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用。Cas9也是一个较大的基因，并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递，虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的。其他方面ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端，因此可以使用标签绑定，如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸（dsODN）是可以进行预测的。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势，绑定门通过设计实现了重组（Ob-LiGaRe）。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点，这是在没有改变接头区的方向实现的，因此通过相同的ZFN/TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化。因为CRISPR产生了一个非粘性末端，直接连接会遇到挑战。最近的文章表明，具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs，并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入。虽然至今还没有出版，但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/Cas9靶向位点的具有CRISPR/Cas的基因组使用。CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势，例如易于构建，花费低，并且产物具有可扩展性，并且能够用于多个靶向基因组位点。