河南农业杂志张小玲

（一）广泛引进国外花椰菜杂交品种自交分离创新种质资源鉴于目前国内花椰菜种质资源贫乏的现状，直接从国外引进优良一代杂种，通过自交分离、纯化，从中筛选出优良的种质资源，是最经济、有效的获得新种质的方法。目前国内花椰菜育种单位利用该方法已分离了大批新的种质资源和自交系，并利用这些种质资源选育出许多优良的花椰菜新品种，如白峰、津雪88、云山1号、丰花60、厦花6号等目前生产上推广的绝大多数品种。（二）种内杂交创造新类型甘蓝类蔬菜的不同亚种或变种间很容易杂交，因此可以通过种内杂交方法，创造优异的种质资源甚至创造新的物种。孙德岭等（2002）采用花椰菜（白菜花）与青花菜、花椰菜与紫花菜、紫花菜与青花菜之间杂交。其后代花球的单球重大大提高，接近于花椰菜，色泽介于父本和母本之间，而维生素C的含量接近青花菜，比花椰菜提高22%～6%，全糖含量比青花菜增加8%～1%（表11-1），口味甜脆，品质和口感都优于其父本和母本，通过进一步选育有望选育出新的花椰菜类型，为花椰菜家族增加新的成员。表11-1 花椰菜新类型全糖、维生素C含量（三）生物技术与花椰菜种质资源创新常规育种在花椰菜种质资源创新方面起了很大的作用，但通常存在能稳定遗传的有益基因狭窄或缺乏；多数有益基因是由许多微效基因控制，且该类基因选择较困难以及基因型差异难以确定等问题。随着生物技术的发展，在传统育种工作的基础上，可以提高育种的针对性，克服常规育种中一些难于解决的问题，进一步拓宽有益种质资源的创新和利用。目前已经有越来越多的研究者注重应用生物技术进行种质资源的创新。细胞工程与花椰菜种质资源创新（1）花药培养和游离小孢子培养技术 20世纪60年代初，Guha和Maheshwari开创了花药培养诱导单倍体的方法。此后花药培养成为诱导单倍体的重要途径之一，并且在作物育种中得到应用。在花椰菜上，王怀名（1992）对嫩茎花椰菜花药和花粉培养中的胚胎发生进行了研究，观察了花药中花粉粒发育成胚状体的过程和再生植株染色体倍性。张小玲（2002）等研究认为，磁场预处理可明显提高花药培养愈伤组织的诱导率。陈国菊（2004年）以5个花椰菜品种为材料进行花药培养，获得再生植株，并得到了种子。由于花药培养的方法不能排除再生植株来自体细胞的可能性，多年来使花药培养获得再生植株的研究进展缓慢。而采用游离小孢子培养的方法可以很好地解决这一难题，因此，游离小孢子培养的方法获得再生植株越来越受到重视。目前该技术已陆续在芸薹属的大白菜、不结球白菜、结球甘蓝、芥蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、大头菜、叶芥、芜菁甘蓝和花椰菜等蔬菜上获得成功。北京农林科学院蔬菜研究工程中心、河南农业科学院园艺研究所、天津科润蔬菜研究所等单位先后开展了花椰菜游离小孢子培养工作，初步建立了花椰菜游离小孢子培养技术体系，在一些品种中获得了花椰菜DH株系，培育出花椰菜优良新品种。通过游离小孢子培养可快速、有效地获得DH纯系。DH株系具有稳定的遗传特性，并能从亲本获得随机排列的配子，由于游离小孢子培养能快速纯合杂合亲本，因此对由多基因控制的特异性状的筛选能一步到位，明显提高了选择几率，加快育种进程。耿建峰等（2002）利用游离小孢子培养产生的两个自交不亲和系配制出具有早熟、耐热、花球洁白、品质好和抗病性强等综合性状优良的花椰菜DH杂交种“豫雪60”，孙德岭（2002）对引进的国内外育种资源材料461份，利用游离小孢子培养和常规技术相结合进行种质资源的创新和对DH株系材料进行评价及鉴定，选育出“津品50”。游离小孢子培养技术也被应用于芸薹属远缘及种间杂交育种中。石淑稳等（1993）分别从甘蓝型油菜与诸葛菜的属间杂种，甘蓝型油菜与白菜型油菜、甘蓝型油菜和芥菜型油菜的种间杂种获得游离小孢子胚和再生植株，为芸薹属植物远缘及种间杂交育种建立了种质资源创新的途径。（2）原生质体融合技术 原生质体融合也称体细胞融合，是两种原生质体的杂交，它不是雌雄配子间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，它可打破种间、属间存在的性隔离和杂交不亲和性，从而广泛地聚合各种优良的基因，使变异幅度显著增大，创造新的种质资源。因而此项技术越来越受到遗传育种学家的重视。自Carlson等在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来，该技术体系不断完善和发展，在许多物种上细胞融合获得成功。20世纪80年代中期已报道有15个种内组合，38个种间组合，13个属间组合获得体细胞杂种植株，到90年代，通过体细胞杂交技术又添加了再生植株的种内杂种14个，种间杂种62个，属间杂种47个，并有2个科间组合的胞质杂种分化获得再生植株。在十字花科芸薹属中已获得融合杂种植株有：拟南芥油菜、甘蓝油菜、甘蓝+白菜型油菜、白菜型油菜+花椰菜。原生质体融合技术与常规有性杂交的差别在于：体细胞杂交中没有减数分裂，有两个二倍体的细胞原生质体融合产生出四倍体的杂种植株，而用同样的亲本有性杂交则只产生二倍体杂种。原生质体融合可以获得细胞质杂种，为培育细胞质雄性不育、抗除草剂等花椰菜品种提供了一条育种新途径。目前，通过有性杂交、回交转育的花椰菜细胞质雄性不育类型主要是Ogura胞质雄性不育类型和Polima胞质雄性不育类型。而利用常规育种转育年限一般需要6～11年，利用原生质体融合技术转移细胞质雄性不育基因可以克服有性回交转育所带来的年限长或杂交不亲和等问题，为花椰菜杂种优势的有效利用开辟了新的途径。惠志明（2005）进行了利用原生质体融合技术向花椰菜转移Ogura萝卜胞质雄性不育的研究，获得了花椰菜与Ogura萝卜胞质甘蓝型油菜种间体细胞杂种植株。由此可见，原生质体融合技术已经应用于花椰菜不育性的研究领域，已获得了大量的雄性不育转育植株，是一条培育雄性不育新种质行之有效的途径。通过原生质体融合可以克服远缘杂交不亲和性，转移野生品种的抗逆性。花椰菜生产中常常遭受病虫害的威胁，而现有育种材料中存在的抗病、抗逆基因，由于长期的人工培育定向选择已日益狭窄，远不能满足进一步提高品种对病害及逆境多抗性的需要。增强对野生材料优异抗性基因的利用，是进一步创新育种基础材料的有效途径。蔬菜野生类型在长期自然选择下形成了高度的抗病性，通过与野生类型进行远缘杂交，可以大幅度提高现有品种的抗病性和抗逆性，但是远缘杂种通常表现不亲和性，严重限制了其在品种改良中的应用。利用原生质体融合技术得到的不对称杂种可以克服远缘杂交不亲和性转移野生种抗性。姚星伟（2005）利用原生质体非对称融合技术向花椰菜中转移野生种抗逆性状（供体Brassica spinescens具有光合效率高，抗白锈病、蚜虫、黑斑病和耐盐等优良特性），试验共获得17株杂种，其抗逆性在进一步鉴定中。可以看出，育种工作者越来越重视野生资源的发掘利用，生物技术中的细胞工程与分子生物学手段相结合是现阶段利用野生资源的有效途径。利用原生质体融合技术可以转移某些品种优良品质性状，为改良花椰菜的营养品质提供新的途径。蔬菜的高产、优质一直是人们所追求的目标。PSJourdan（1989）利用花椰菜与具有除草剂抗性的Brassica napus进行原生质体融合试验，获得了具有高抗除草剂特性的杂种植株。BNavratilove等（1997）以花椰菜和抗根瘤病的Armoracia rusticana为试验材料，利用原生质体融合技术，获得了花椰菜与Armoracia rusticana体细胞杂种植株。Hu（2002）用Brassica napus和具有亚油酸和软脂酸含量高的Orychophragmus violaceus进行体细胞融合试验，通过原生质体融合试验得到的杂种植株不但亚油酸和软脂酸含量升高，而且芥子酸的含量明显下降，显著改善品种品质。分子标记技术与花椰菜种质资源创新利用易于鉴定的遗传标记辅助选择是提高选择效率和降低育种盲目性的重要手段。近20年迅速发展起来的分子标记技术给作物育种提供了新的途径。运用DNA分子标记可以进行早期选择，提高选择的准确度和育种效率，有助于缩短育种周期。（1）利用分子标记技术筛选自交不亲和系 自交不亲和性是高等植物为实现异花授粉受精和遗传重组而形成的一种重要的遗传特性，国内外学者对自交不亲和性的遗传机制做了大量研究。据Lewis（1979）报道，已在74个科的被子植物中发现了自交不亲和性。国内利用分子标记技术筛选自交不亲和系的研究也有所报道，黄聪丽（2001）应用RAPD分析方法，得到了与花椰菜自交不亲和性相关的差异片段。宋丽娜（2005年）运用RAPD和ISSR分子标记技术，分离到鉴别自交不亲和性的连锁标记。（2）利用分子标记技术鉴定抗病种质资源 张峰（1999）利用AFLP技术在一对花椰菜抗、感黑腐病的近等基因系中筛选到4个与抗黑腐病基因紧密连锁的标记。刘松（2002）用天津科润蔬菜研究所抗黑腐病近等位基因系C712和C731作为材料，筛选出与花椰菜抗黑腐病基因RXC连锁的RAPD标记OP224/1600，将其转化成更加稳定的SCAR标记，可快速准确筛选抗病材料。古瑜（2007年）以花椰菜抗病和感病近等基因系为实验材料，对花椰菜抗病和感病近等基因系基因组进行了ISSR分析，得到3个与抗病基因有关的分子标记ISSR11000、ISSR21500和ISSR18700，可进一步应用于分子标记辅助育种。此外，利用cDNA-AFLP技术对致病菌胁迫的花椰菜抗黑腐病系进行差异表达分析，初步得到一个与抗黑腐病相关的基因片段，并证实该片段是受诱导的与诱导系统抗性（ISR）信号传导有关的基因片段。此外，利用同源序列候选基因法和NBS profiling方法，在抗病系中得到2个抗病基因同源序列RGA330-7和NBS5-100，序列分析表明这两个片段可能与花椰菜抗黑腐病基因有关。进一步将两个RGA推测的蛋白序列与7个已知植物抗病基因的蛋白序列进行比较，构建了分子进化树。聚类结果表明，本研究得到的两个RGA片段应属于non-TIR-NBS-LRR型。最后，利用表观遗传学的分析方法，对致病菌胁迫前后基因组中胞嘧啶甲基化水平和甲基化模式的变异进行分析，从基因表达调控的角度探讨了抗黑腐病的分子机制。（3）利用分子标记技术检测遗传变异 突变既可以发生在整个基因组，也可以发生于特定的基因或基因簇、结构基因、调节基因，以及单个核苷酸等。突变既可以自发也可以人工诱变在不用诱变剂处理的培养植物细胞中，突变体频率一般为10-5～10-8，用诱变剂处理，可增至10-3，但诱变剂常会引起育性降低等副作用。Leroy（2000，2001）等利用花椰菜下胚轴进行组织培养，用ISSR方法检测了愈伤组织形成过程、胞增殖过程以及成苗后的再生植株等各阶段的植株间多态性，认为组织培养诱导的再生植株具有遗传多态性，证明组织培养可诱发与筛选遗传变异。（4）利用分子标记技术筛选花椰菜雄性不育种质资源 植物雄性不育是一种不能产生有活力花粉的遗传现象，在植物界中广泛存在，目前已在43科162个属320个种的617个品种或种间杂种中发现了雄性不育现象，它在作物杂种优势利用上具有重要价值。Chunguo Wang（2006）以花椰菜雄性不育品种NKC-A和恢复系NKC-B为材料，利用引物P6+/P6-进行PCR扩增，发现了一条300bp的差异片段，此片段可以作为鉴别雄性不育系的分子标记。王春国（2005）利用同源序列的候选基因法，通过检索NCBI核酸以及蛋白数据库，获得花椰菜kndx612细胞质雄性不育相关的基因或开放读码框，初步结果显示试验所用不育花椰菜胞质亦可能为Ogura型，为进一步从分子水平研究和利用花椰菜雄性不育基因提供了条件。（5）花椰菜遗传连锁图谱的构建及在育种中的应用 遗传连锁图谱是指以染色体重组交换率为相对长度单位，以遗传标记为主体构成的染色体线状连锁图谱，分子标记遗传连锁图表示各标记所对应的DNA片段在染色体上的相对位置，是分子标记运用于作物遗传育种的基础，构建分子标记连锁图的理论基础是染色体的交换和重组。自1986年以来，主要农作物都已建立了以RFLP为主的分子遗传图谱，分子标记连锁图，是进行基因定位、基因克隆、辅助选择进行作物设计育种的技术平台。在遗传学理论、功能基因组学以及遗传育种等领域已显示出了十分重要的作用。Li（2001年）等利用SRAP、AFLP技术对86个羽衣甘蓝×花椰菜的RI作图，此图由130个SRAP标记和120个AFLP技术构成，这些标记非常平均地分布在9个连锁群，覆盖2165cM。古瑜（2007年）利用AFLP和NBS profiling两种方法，以花椰菜品种间杂交F2代为作图群体，构建了第一张花椰菜遗传连锁图谱。该图谱包括9个连锁群，连锁群的总长度为4cM，相邻标记间的平均图距为9cM，在所包含的234个AFLP标记和21个NBS标记中NBS标记分布于8个连锁群且在基因组中成簇排列。该图谱通过提供可能的抗性基因位点，对进一步得到抗性基因很有帮助。同时研究RGA在整个花椰菜基因组中的分布与组成，也为了解抗性基因的分布与演化提供参考。进一步可用于分子标记辅助育种。（6）花椰菜不同花色种质资源的创新 近年来，利用基因工程技术已经获得了许多传统园艺技术难以获得的新品种，如紫色、白色以及紫白相嵌的3种不同颜色的矮牵牛花。而这些技术通常要求对相关基因有所了解，以获得目的基因的cDNA，然后将这些外源基因导入目标植物中，达到改变花色、花型等目的。Crisp等利用遗传上一致的白色花球品种和绿色品种杂交，从杂交后代遗传表现提出一种模型：Wiwi基因控制白色对黄色是显性，非独立共显性基因gr1gr2表现为绿色。Dickson报道了在埃及引进的花椰菜品种PI 183214，即便完全暴露于阳光下，花球也是纯白色的。并认为是由2或3对显性基因控制的。Singh等报道了由两对基因控制的可以遮盖住花球的叶片，以防止阳光照射引起的花球变色。李凌等（2000）对花椰菜黄花和白花的近等基因系进行了研究，筛选到了一个白花株系的特异带，通过Northern点杂交初步鉴定其为白花株系所特有，同时利用Smart cDNA-AFLP银染技术对花椰菜黄花近等基因系的mRNA进行了分析，其中2对引物的3条带在2个表达基因文库之间存在多态性，其中一条与白花品系共分离；筛选到一条白花株系的差异片段，本研究为克隆与花色相关基因奠定了基础。转基因技术与花椰菜种质资源创新转基因技术的发展对加速创新花椰菜种质资源具有重要意义。目前，已育成一大批雄性不育、抗病、抗虫、品质优良的花椰菜新品种，并产生了很大的社会和经济效益。（1）花椰菜雄性不育种质资源创新 近年，花椰菜雄性不育研究取得了进展，已从中找出一些与不育相关的基因或者嵌合体。这对进一步阐明花椰菜雄性不育发生的分子机理，指导新不育系的培育打下了基础。Bhalla（1998）把与花粉相关的基因Bcp1整合到质粒PBI101中，通过根瘤农杆菌介导转入花椰菜子叶中，获得了50%花粉不育的花椰菜不育新种质。（2）花椰菜抗病虫种质资源创新 在花椰菜抗病基因的克隆和转移方面也有报道，张桂华等（2001）以花椰菜栽培品种“春秋”为试验材料，在携带CaMV Bari-1基因Ⅵ的根瘤农杆菌菌种GV3101的介导下，获得了经筛选转化的花椰菜转基因幼苗，为培育抗花椰菜花叶病毒型品种提供可能。花椰菜转基因抗虫研究中最常用的外源基因有两种：内毒素（Bt）基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因，这两种基因已经成功转入花椰菜中，为利用转基因技术创新花椰菜种质资源提供了宝贵经验。华学军（1992）、蔡荣旗（2000）、徐淑平（2002）、周焕斌（2003）等都利用农杆菌介导将Bt基因转入花椰菜中，成功获得了转基因植株。CpTI基因属于Bowman-birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制包括鳞翅目、鞘翅目、直翅目等多种害虫中肠中胰蛋白酶的活性，具有广谱抗虫性。吕玲玲（2004）通过根瘤农杆菌介导，将豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因整合到花椰菜植株的基因组中，对鳞翅目虫害青虫的生长发育有一定的抑制作用。徐淑平（2002）用根癌农杆菌介导的遗传转化法将Bt基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI）导入花椰菜，获得了转基因花椰菜植株。Ding（1998）等利用农杆菌介导，从当地甘薯中分离得到的抗虫基因TI转入花椰菜中，结果表明，转基因植株比对照植株抗虫效果明显。（3）与花椰菜花球性状有关的突变基因的研究进展 Bowman（1993）等首先在拟南芥中发现了花球突变体cauliflower。随后Kempin SA（1995）等从拟南芥中分离得到两个与花的分生组织活性有关的CAULIFLOWER和APETALA1基因，研究表明：其功能为转录因子。同时对花椰菜栽培种中该基因的同源基因研究发现：花椰菜中其同源基因是无功能的。这暗示了花椰菜肉质花序形态的形成机理与该基因密切相关。Purugganan（2000）等研究了野生型和栽培型花椰菜中CAL基因的多态性，发现野生型和栽培型CAL基因存在差异，栽培型花椰菜中该基因的第五个外显子有一个等位基因位点发生了突变。Lee BSmith（2000）以BoCAL和BoAP1两个隐性等位基因在特殊位点上的分离为切入点，研究了花椰菜花球的起源和进化过程，得到花球发育的遗传模式，认为：BoCAL-a等位基因与离散花序的形态之间存在很强的相关性。以上的结果都表明：CAL基因的突变抑制花分生组织发育，这是花椰菜花球形成的遗传基础。赵升等（2003）、曹文广（2003）、李小方（2000）通过把甘蓝BoCAL基因转入花椰菜中，转基因花椰菜不能形成花球，证实外源基因BoCAL能够部分补偿花椰菜BobCAL基因功能的丧失，部分恢复花椰菜的花球表型。因此可以通过控制BoCAL基因的突变程度和基因的表达水平，调节花球的发生时间和发育速度，从而为培育结球紧实度高的花椰菜新品种提供新的途径。在生产实际中，花球采收后，其内源激素和营养成分的变化造成内在品质逐渐降低，严重的影响产品的商品性和食用的营养价值。花球的衰老首先出现在萼片的叶绿素丧失。乙烯的合成与叶绿素的丧失以及随后的黄化成因果关系。ACC氧化酶（ACO）是乙烯合成的一个限速酶，并且ACO基因的表达调控着乙烯的生成速率。从基因上对ACO基因的表达进行调控，可延缓乙烯的生成，这已经在许多作物上获得成功。陈银华（2005年）根据亲缘关系较近的几种作物ACC氧化酶氨基酸序列，设计一对简并引物，从花椰菜基因组中获得长1202bp的候选片段，并获得花椰菜抗衰老的新材料。

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